二、形成厭氧環境

1. 第一次氮氣置換：

   • 把乳膠手套套在觀察板法蘭圈上并扎緊。
   • 接通氮氣進氣路，打開氮氣控制閥，使兩只塑料袋充足氮氣后，關閉電磁閥，然后扎緊袋口。
   • 把塑料袋內氮氣漸漸地放于操作室內，至全部放出。

2. 第二次氮氣置換：重復一次充氮過程，取樣室先抽真空，并注意隨時開閉排氣閥。

3. 第三次氮氣置換：再次重復充氮過程，確保操作室內氮氣濃度。

4. 混合氣體置換（混合氣體配比根據實際需求，如N2 85%、H2 10%、CO2 5%或H2 1/85%、H2 1/10%、CO2/15%等）：

   • 調換氣路打開操作室混合氣閥進氣，充氣時取樣室先抽真空，并注意隨時開閉排氣閥。
   • 混合氣充滿塑料袋后，關閉電磁閥，并打開混合氣限流閥，使混合氣經過穩流器、流量計，調整流量計使流量為每分鐘10毫升左右。
   • 把塑料袋內混合氣漸漸排于操作室內。通過三次換氣后，操作室內氣體含氧量已處于極微量狀態。

5. 催化除氧：操作室內打開鈀粒除氧劑，接通除氧催化器電源進行催化除氧。1~2小時后（具體時間根據設備性能而定），打開厭氧指示條觀察其變色情況，如指示條變色（由深藍變為淺藍）則為操作室內達到厭氧環境。

三、滅菌處理

開啟紫外線滅菌燈，對操作室內進行滅菌處理。滅菌時間根據實驗需求自定。

四、菌種置入與培養

1. 檢查并關緊取樣室內門。
2. 打開取樣室外門：將菌種放入取樣室后即關上外門。
3. 取樣室充氮置換：打開真空泵，先抽真空度（如500毫米汞柱以上），然后人工打開氮氣閥進氣，使指針回復零位后關掉氮氣閥。重復此過程三次，以確保取樣室內氮氣濃度。第三次操作時，可打開混合氣體閥進混合氣，使指針回復零位后關掉混合氣體閥。
4. 檢驗真空度：如選定真空度較低則需要增加置換的次數。取樣室外門開啟、關緊后，再抽低真空度（如100毫米汞柱）進行檢驗。

五、長期連續使用條件

1. 定期觀察：每天在操作室內打開厭氧指示條觀察，如指示條變色不正常則需重新換氣。
2. 連續輸入混合氣體：要長期連續輸入微量的混合氣體，使補進的氮氣能和微量的氧結合通過催化吸收，保證室內厭氧狀態。補入混合氣流量可選定為每分鐘10毫升左右。
3. 更換除氧劑和干燥劑：連續培養運行時，每天更換一次除氧劑和干燥劑。換下的除氧劑和干燥劑可放在200℃干燥箱內干燥2~3小時以復原。

六、注意事項

1. 設備安裝：整機應安放在溫度溫差較小、操作方便的位置，避免陽光直曬和遠離采暖設備，放置要平穩。
2. 儀表安裝：儀表應盡可能地安裝于空氣清靜、溫度變化較小的地方。
3. 熟悉設備：開機前應全面熟悉和了解各組成配套儀器、儀表的說明書，掌握正確的使用方法。
4. 故障處理：如發生故障（如停氣等），操作室內仍可保持一段時間（如10~12小時）的厭氧狀態。超過此時間則根據需要把培養物取出另作處理。
5. 氣瓶更換：調換氣瓶時，注意要扎緊氣管，避免流入含氧氣體。
6. 真空泵維護：真空泵應按要求使用，并定期檢查加油。

通過以上步驟，可以正確、有效地使用厭氧培養箱進行厭氧菌的培養。